Estudio inmunoquímico de la cascada de señalización de apoptosis de Giardia intestinalis: Énfasis en la interacción GCAD-IGCAD, caspasa-3 y flipasas

Abstract

Giardia intestinalis es un eucarionte primitivo, en el cual la información sobre el proceso de apoptosis es limitada. Nuestro grupo de investigación identificó la DNasa activada por caspasas de Giardia intestinalis (GCAD), así como su inhibidor IGCAD. En metazoarios se ha observado que caspasa-3 (casp-3) escinde al inhibidor de CAD (ICAD), esto libera a CAD, quien efectúa la fragmentación del DNA. Igualmente, casp-3 escinde a las flipasas ATP11A y ATP11C durante la apoptosis, lo que promueve la exposición de la fosfatidilserina (PS). En este escenario, en el presente trabajo se realizó un estudio inmunoquímico de la cascada de señalización de apoptosis de G. intestinalis iniciando con la purificación de rIGCAD, se obtuvo una proteína de 43 kDa. rIGCAD fue utilizada para la producción de anti-IGCAD que reconocieron la proteína recombinante y la proteína en el lisado de G. intestinalis. El anti-IGCAD nos permitió observar la interacción IGCAD-GCAD in vitro. Para determinar si la activación de GCAD y desactivación de flipasas es mediada en G. intestinalis por una proteasa similar a las caspasas se realizó la búsqueda de ortólogos. Se identificaron in silico dos proteínas con el dominio catalítico tipo caspasa, la separasa y la transaminasa de anclaje GPI de G. intestinalis (TAGPIGi). Además, se realizó una identificación inmunoquímica con el anti-caspasa-3 de H. sapiens una proteína con alrededor de 50 kDa y otra con un peso molecular aproximado al de la separasa de G. intestinalis (~179 kDa). Estas proteínas han sido pobremente caracterizadas en diversos protozoarios parásitos, por lo que en este trabajo se realizó la identificación y clonación de las regiones de 654 pb de la separasa y 729 pb de TAGPIGi. Asimismo, en la búsqueda de ortólogos de flipasas de G. intestinalis encontramos tres flipasas IA y 2 IIB, que contienen dominios estructurales característicos de flipasas, en los que destacan los sitios diana para caspasas. Además, se realizó la clonación de la región de 621 pb que consiste en el dominio A de la flipasa IA de G. intestinalis y posteriormente se purificó la proteína de 23 kDa. La clonación y producción recombinante de las proteínas correspondientes permitirá continuar con el estudio de la cascada de señalización de apoptosis en G. intestinalis.