Análisis de expresión génica y actividad de enzimas de síntesis de almidón y su asociación con la modificación del endospermo en maíz de calidad proteínica

Abstract

El maíz de calidad proteínica (QPM) resulta de la conversión del endospermo blando de la mutante opaco2 (o2) en vítreo. Estudios previos con líneas recombinante puras (RIL) derivadas de la cruza entre K0326Y-QPM y W64Ao2 sugieren que esta modificación del endospermo en QPM está asociada con la expresión y actividad de enzimas de síntesis almidón durante el desarrollo del grano. El objetivo del presente estudio fue analizar cambios en la expresión y actividad de enzimas de síntesis de almidón relacionados con la modificación del endospermo en QPM. Se utilizaron las líneas K0326Y-QPM y W64Ao2, así como una selección de RIL derivadas de su cruza y contrastantes en vitrosidad. Se obtuvieron endospermos en desarrollo a los 28 días después de la polinización (DDP), de los cuales una parte se liofilizó para obtener harina y medir el contenido de almidón total. Del endospermo en desarrollo se aisló el almidón y se determinó su composición, propiedades térmicas, grado de hinchamiento y patrón de ramificación de la amilopectina; también se analizaron las proteínas involucradas en su biosíntesis. Se extrajo RNA para el análisis de expresión de cuatro genes involucrados en la síntesis de almidón: Brittle2 (Bt2), Waxy1 (Wx1), Amylose extender1 (Ae1) y Pullulanase (Zpu1). También se prepararon extractos proteicos para medir la actividad de enzimas codificadas por estos genes: ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa), almidón sintasa unida al gránulo (GBSSI), enzima ramificadora (SBE) y desramificadora (PUL). Se determinaron las secuencias nucleotídicas de las variantes alélicas de K0326Y-QPM y W64Ao2 del gen Ae1 que codifica para SBE y se expresaron en Escherichia coli para determinar si las enzimas codificadas difieren en actividad. El análisis de la composición química del almidón reveló que el contenido de amilosa fue mayor en las líneas vítreas con respecto a las opacas, mientras que en el caso del contenido de almidón y amilopectina se observó lo opuesto. El almidón de las líneas vítreas presentó menor grado de hinchamiento (GH), menor entalpía de gelatinización (ΔHg) y mayor porcentaje de retrogradación (%R), lo cual correspondió con el mayor contenido de amilosa en estas líneas. La expresión del gen Wx1, la acumulación y la actividad de GBSSI fueron superiores en las líneas vítreas respecto a las opacas, lo cual correspondió con el contenido de amilosa, mientras que la expresión de Ae1 y actividad de SBE fue mayor en líneas opacas respecto a las vítreas y correspondió con el contenido de amilopectina. Las secuencias de las SBE codificadas por las variantes del gen Ae1 en K0326Y-QPM y W64Ao2 variaron en cinco aminoácidos, de los cuales algunos parecen afectar el sitio catalítico de la enzima, lo cual podría ser responsable de la menor actividad de SBE y contenido de amilopectina observados en las líneas vítreas. Sin embargo, las SBE recombinantes producidas en E. coli mostraron una actividad similar. Los resultados sugieren que la modificación del endospermo en QPM está asociada con cambios en la expresión y actividad de las enzimas de biosíntesis del almidón que afectan la composición del almidón durante el desarrollo del endospermo, así como sus propiedades fisicoquímicas y estructurales. La mayor actividad de GBSSI y la menor actividad de SBE producen gránulos de almidón con mayores proporciones de amilosa y regiones amorfas, favoreciendo una mayor compactación entre estas estructuras, contribuyendo al fenotipo vítreo en QPM.